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在當今社會，全球每年產生約3億噸的塑料廢棄物，其中一部分被自然環境分解成微塑料（MPs，直徑小于5毫米）和納米塑料（NPs，直徑小于100納米）。與微塑料相比，納米塑料可能因其更小的尺寸更容易進入組織和器官，因此可能具有更嚴重的毒性效應。聚苯乙烯納米顆粒（PS-NPs）作為一種納米塑料被廣泛用于制造發泡聚苯乙烯、玩具、光盤和杯蓋等產品。先前的研究已經發現PS-NPs（直徑20納米）可以從小鼠母體肺部轉移到胎盤和胎兒組織，從而影響小鼠胎兒的發育。因此，對PS-NPs的生殖毒性進行深入的研究顯得迫切。

2024年1月22日，中山大學附屬第八醫院研究員張慧東團隊發現PS-NP的暴露激活了自噬過程，抑制了SOX2介導的ROCK1基因轉錄，從而影響了細胞的遷移/侵襲和遷移體(Migrasome)的形成，最終導致了流產。通過補充小鼠SOX2或ROCK1可以有效挽救這些影響，為我們了解PS-NPs對女性生殖健康的毒理效應提供了洞察。該研究成果以“Polystyrene Nanoplastics Activate Autophagy and Suppress Trophoblast Cell Migration/Invasion and Migrasome Formation to Induce Miscarriage”為題，發表在ACS Nano期刊上。共同第一作者是中山大學附屬第八醫院萬叔坤, 王曉慶, 和陳維娜。

摘要圖。

【PS-NPs的特性】

首先，通過透射電子顯微鏡（TEM）對PS-NPs和mCherry-PS-NPs的表面形態進行了表征。結果顯示，PS-NPs和mCherry-PS-NPs呈規則的球形（圖1A）。動態光散射（DLS）分析顯示PS-NPs的平均直徑為57.2 ± 14.8納米（圖1B）。隨后，通過傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）對新鮮PS-NPs和在滋養層細胞裂解液中培養24小時的PS-NPs的表面修飾進行了表征。結果顯示，在與細胞裂解液共培養后，PS-NPs相對惰性，沒有出現新的吸收峰（圖1C），表明在滋養層細胞中PS-NPs具有惰性表面。通過流式細胞儀分析評估了PS-NPs（使用mCherry-PS-NPs作為熒光探針）在滋養層細胞中的內吞作用。結果發現，PS-NPs可以在1小時內輕松地被滋養層細胞Swan 71細胞內吞，并至少在24小時內保持穩定（圖1D）。PS-NPs 暴露的 Swan71 細胞的TEM圖像顯示，PS-NPs位于大的液泡中，并且在細胞質中自由分布（圖1E，紅色箭頭指示顆粒）。

圖1. 聚苯乙烯納米顆粒（PS-NPs）的表征和內吞作用。

【PS-NPs對人滋養層細胞的不良影響】

為了研究PS-NPs對人滋養層細胞的逆境影響，Swan 71細胞被暴露于0、50、100、150或200 μg/mL的PS-NPs中。透過膜實驗顯示，隨著PS-NP濃度的增加，Swan 71細胞的遷移/侵襲逐漸受到抑制（圖2A，B）。PS-NP 暴露的 Swan 71 細胞中，兩種典型的遷移體(Migrasome)形成蛋白指示物質 TSPAN4 和 NDST1 的蛋白水平也呈濃度依賴性降低（圖2C？E），表明PS-NPs可能抑制遷移體(Migrasome)的形成。進一步的migrasome實驗顯示，在轉染了TSPAN4-EGFP的人滋養層細胞中形成了migrasomes，而PS-NP 暴露后migrasome的數量減少（圖2F，G）。此外，在暴露于mCherry-PS-NPs（5 μg/mL，以清晰可見其共定位的方式）的滋養層細胞中，發現PS-NPs和遷移體(Migrasome)共定位，表明PS-NPs可能進入遷移體(Migrasome)并通過遷移體(Migrasome)釋放到細胞外（圖2H）。總體而言，這些結果表明PS-NP 暴露抑制了人滋養層細胞的遷移/侵襲和遷移體(Migrasome)形成。

圖2. PS-NP 暴露抑制了人滋養層細胞的遷移/侵襲和遷移體(Migrasome)的形成。

【PS-NPs通過下調ROCK1抑制了人滋養層細胞的遷移/侵襲和遷移體(Migrasome)形成】

研究探索了哪些蛋白可能參與了PS-NP抑制的滋養層Swan 71細胞的遷移/侵襲和遷移體形成。為此，在PS-NP暴露的人滋養層細胞中檢測了幾個對滋養層細胞遷移/侵襲具有功能的經典信號通路。這些基因中，Rho-ROCK信號通路表現出顯著的變化（圖3A,B）。ROCK家族包含兩個成員，ROCK1和ROCK2，兩者在激酶結構域中具有高度的序列相似性，對多個細胞骨架功能起作用。實驗證實，在PS-NP 暴露的滋養層細胞中，ROCK1的mRNA和蛋白水平均隨著PS-NP濃度的增加而降低（圖3C？E）。為驗證ROCK1在滋養層細胞中的功能，通過轉染其過表達質粒使Swan 71細胞過表達ROCK1（圖3F？H）。ROCK1的過表達促進了滋養層細胞的遷移/侵襲和遷移體形成，并且ROCK1的過表達還能夠挽救PS-NP暴露的滋養層細胞中被抑制的遷移/侵襲和遷移體的形成（圖3I？L）。因此，這些結果表明PS-NP暴露通過下調ROCK1抑制了人滋養層細胞的遷移/侵襲和遷移體的形成。

圖3. PS-NPs通過下調ROCK1抑制了遷移/侵襲和遷移體形成。

【PS-NPs暴露通過抑制SOX2介導的ROCK1轉錄，降低了ROCK1在人滋養層細胞中的表達】

研究首先探討了ROCK1的轉錄因子。SOX2在胚胎發育中是必不可少的，對于維持胚胎細胞和各種成體干細胞群體的干性起著至關重要的作用。通過PROMO軟件分析，SOX2可能識別ROCK1的啟動子序列。SOX2的過表達上調了ROCK1和SOX2的mRNA和蛋白水平，而SOX2的敲低下調了滋養層細胞中ROCK1和SOX2的mRNA和蛋白水平（4A？C）。同時，PS-NP 暴露降低了PS-NP 暴露的滋養層細胞中SOX2的mRNA 和蛋白水平（圖4D？F）。SOX2的ChIP實驗證明在滋養層細胞中，SOX2可以富集ROCK1的啟動子區域，而在PS-NP 暴露的滋養層細胞中，這種富集減少了（圖4G）。雙熒光素酶報告基因實驗還揭示，SOX2在使用ROCK1的野生型啟動子序列時具有轉錄活性，而在使用突變啟動子序列時沒有此轉錄活性；PS-NP 暴露降低了滋養層細胞中的這種轉錄活性（圖4H）。此外，研究還發現SOX2的過表達可以恢復PS-NP 暴露降低的ROCK1的mRNA和蛋白水平（圖4I？L）。至于細胞表型，SOX2的過表達挽救了PS-NP暴露下降的滋養層細胞的遷移/侵襲和遷移體的形成（圖4M？P）。因此，這些結果表明在PS-NP 暴露的滋養層細胞中，PS-NP 暴露通過抑制SOX2介導的ROCK1轉錄，降低了ROCK1的表達，從而抑制了遷移/侵襲和遷移體的形成。

圖4. PS-NP 暴露抑制了SOX2介導的ROCK1轉錄。

【PS-NPs如何通過促進SOX2的自噬降解來降低其在滋養層細胞中的表達】

通過使用環己酰胺（CHX）處理阻斷蛋白質翻譯的滋養層細胞，確定了SOX2蛋白的穩定性。結果顯示，聚苯乙烯納米顆粒（PS-NPs）促進了PS-NP 暴露的Swan 71細胞中SOX2蛋白的降解（圖5A,B）。一般而言，蛋白質通過泛素-蛋白酶體和自噬-溶酶體途徑降解，我們通過使用MG132或氯 喹（CQ）處理細胞阻斷了這兩個途徑。在PS-NP 未暴露或暴露的細胞中，CQ處理導致SOX2蛋白積累，而MG132處理則沒有這種效果（圖5C,D）。這表明在人滋養層細胞中，SOX2蛋白主要通過自噬-溶酶體途徑降解。LC3B I到LC3B II的轉化以及P62在自噬過程中的降解是自噬的兩個典型指標。在PS-NP 暴露的細胞中，LC3B II/I蛋白水平比例增加，P62蛋白水平減少，表明PS-NP 暴露促進了自噬（圖5E？G）。氯 喹（CQ）通過阻斷溶酶體酸化和防止其與自噬體融合來抑制自噬，處理細胞后LC3 II的降解被有效防止。GFP-LC3質粒的共聚焦實驗顯示，PS-NP 暴露導致LC3 斑點的增加，與CQ聯合處理進一步加強了這種效應，說明PS-NP 暴露增強了滋養層細胞中的自噬（圖5H,I）。PI3K/Akt/mTOR通路對自噬的啟動至關重要，而PS-NP 暴露導致這些通路中PI3K p110β、磷酸化-Akt（p-Akt）和磷酸化-mTOR（p-mTOR）蛋白水平的濃度依賴性降低（圖5J）。CQ的聯合處理挽救了PS-NP 暴露引起的遷移/侵襲和遷移體形成的下調（圖5K？N）。總體而言，這些結果表明PS-NP 暴露通過抑制AKT通路、激活自噬、促進SOX2的自噬降解，從而降低了SOX2和ROCK1的蛋白水平，最終抑制了PS-NP 暴露的人滋養層細胞中的遷移/侵襲和遷移體形成。

圖5. PS-NPs促進人滋養層細胞中SOX2的自噬降解。

【PS塑料碎片、自噬、遷移/侵襲以及UM和HC絨毛組織中的遷移體形成】

在人流產組織（UM）和對照組絨毛組織（HC）中檢測到PS塑料碎片，并發現UM組織中的PS塑料碎片含量較高。邏輯回歸模型分析表明，絨毛組織中PS塑料碎片含量較高（OR = 8.72; 95% CI, 2.92？26.04）與流產相關，并可視為流產的風險因素（圖6A）。在UM與HC組織中，SOX2、ROCK1和TSPAN4的mRNA水平較低。蛋白水平方面，UM組相較于HC組，SOX2、ROCK1、TSPAN4、NDST1和P62的蛋白水平較低，LC-3BII/I蛋白水平比例較高，與PS-NP 暴露的滋養層細胞中的結果一致（圖6C？H）。免疫組織化學分析顯示，UM組織中的SOX2蛋白水平較HC組織低（圖6I,J）。相關性分析顯示，在UM組織中，SOX2蛋白水平與ROCK1 mRNA水平呈正相關。SOX2 ChIP實驗證明，在UM相較于HC組織中，SOX2富集的ROCK1啟動子區域水平較低。SOX2和ROCK1的蛋白水平與UM組織中的PS塑料碎片含量呈負相關（圖6K？N）。綜合細胞和絨毛組織水平的結果，這些研究表明UM組中PS塑料碎片含量增加，自噬增強，SOX2蛋白水平降低，SOX2介導的ROCK1轉錄受到抑制，遷移/侵襲和遷移體形成受到抑制，從而可能導致流產。

圖6. 在健康對照組（HC）和流產組（UM）絨毛組織中的自噬、遷移/侵襲和遷移體形成。

【通過補充小鼠SOX2或ROCK1，恢復了PS-NP 暴露小鼠模型中的遷移/侵襲和遷移體形成，并減少了流產率】

在PS-NP暴露的小鼠模型中，通過給予小鼠注射過表達小鼠SOX2或ROCK1的質粒，補充實驗證實了PS-NP 暴露、SOX2/ROCK1、遷移/侵襲、migrasome形成和流產之間的因果關系。研究中構建了一個小鼠流產干預模型，其中PS-NP 暴露的小鼠腹腔內注射過表達小鼠SOX2或ROCK1的質粒（圖7A）。在我們的預實驗中，發現暴露于生理鹽水或每天25 mg/kg的PS-NPs并未顯示明顯的胚胎吸附，而50或100 mg/kg的PS-NPs的暴露則顯示出明顯的胚胎吸附。為了清晰顯示干預效果，我們在這些實驗中選擇了每天100 mg/kg的PS-NPs。首先，PS-NP 暴露增加了胚胎吸附和提高了流產率；然而，補充SOX2減少了胚胎吸附并降低了流產率（圖7B,C）。在小鼠流產干預模型中，通過補充小鼠ROCK1，ROCK1的補充減少了由PS-NP 暴露引起的胚胎吸附和流產率（圖7G,H）。總體而言，這些結果證實了PS-NP 暴露降低了SOX2和ROCK1的表達水平，抑制了遷移/侵襲和遷移體形成，并進一步降低了流產率。補充小鼠SOX2或ROCK1能有效恢復小鼠胎盤組織中的遷移/侵襲和遷移體形成，減輕了PS-NP 暴露小鼠的流產率。

圖7. 補充SOX2或ROCK1恢復了PS-NP 暴露的孕鼠模型中的遷移/侵襲和遷移體的形成，并緩解了流產。

【小結】

這項研究發現，暴露于PS-NPs導致了懷孕小鼠的流產。PS-NPs抑制了ROCK1介導的細胞遷移/侵襲和遷移體形成。SOX2被確定為ROCK1的轉錄因子。PS-NPs激活了自噬并促使SOX2的自噬降解，從而抑制了SOX2介導的ROCK1轉錄。通過補充SOX2或ROCK1，可以有效挽救細胞遷移/侵襲和遷移體形成，并減輕小鼠模型中的流產。在PS-NP 暴露的滋養層細胞、UM患者絨毛組織以及PS-NP 暴露的小鼠胎盤組織中對SOX2、ROCK1、TSPAN4和NDST1蛋白，以及P62和LC-3BII/I的分析得出了一致的結果。這項研究揭示了納米塑料的生殖毒性，并發現了其潛在的調控機制，表明納米顆粒的暴露是女性生殖健康的危險因素。

圖8. 潛在的調控機制。